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Bio-Rad_iCycler iQ熒光定量PCR儀的操作技巧與使用心得分享
更新時(shí)間:2025-03-06   點(diǎn)擊次數(shù):200次
   Bio-Rad_iCycleriQ熒光定量PCR儀是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常用設(shè)備,其精準(zhǔn)的溫度控制和靈敏的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)為基因表達(dá)分析、SNP分型等研究提供了可靠保障。要充分發(fā)揮這臺(tái)儀器的性能,需要掌握一些關(guān)鍵的操作技巧。
 
  在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段,耗材的選擇至關(guān)重要。推薦使用低吸附的PCR管或96孔板,并確保管蓋閉合。反應(yīng)體系的配制需要在冰上進(jìn)行,各組分要充分混勻。引物和探針的濃度需要優(yōu)化,通常引物終濃度為0.2-0.5μM,探針終濃度為0.1-0.2μM。模板DNA的加入量建議在1-100ng之間,過高可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降。
 
  程序設(shè)置是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。退火溫度需要根據(jù)引物的Tm值確定,通常比Tm低3-5℃。延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度設(shè)置,一般按每分鐘延伸1kb計(jì)算。建議設(shè)置熔解曲線分析步驟,以驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。對(duì)于多重PCR,需要仔細(xì)優(yōu)化各通道的熒光采集溫度,避免信號(hào)干擾。
 
  數(shù)據(jù)分析時(shí),要正確設(shè)置基線范圍和閾值線?;€通常選擇3-15個(gè)循環(huán),閾值線設(shè)置在指數(shù)擴(kuò)增期的線性范圍內(nèi)。對(duì)于相對(duì)定量,需要選擇合適的內(nèi)參基因,并使用ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。絕對(duì)定量則需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,確保擴(kuò)增效率在90%-110%之間。
 
  儀器維護(hù)不容忽視。每月清潔樣品槽和光學(xué)系統(tǒng),使用無水乙醇擦拭樣品槽,用鏡頭紙清潔光學(xué)元件。每季度校準(zhǔn)溫度控制系統(tǒng),使用專用校準(zhǔn)試劑盒驗(yàn)證各孔溫度準(zhǔn)確性。每年進(jìn)行全面的光學(xué)系統(tǒng)校準(zhǔn),確保熒光檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。
 
  掌握這些操作技巧,就能充分發(fā)揮Bio-Rad_iCycleriQ熒光定量PCR儀的性能,獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。隨著使用經(jīng)驗(yàn)的積累,實(shí)驗(yàn)人員還能根據(jù)具體研究需求,開發(fā)出更優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案。
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